Fluorescentne mikroskopije: načela metoda

Apsorpcija i ponovno emisija svjetlosti dalje neorganskih i organskih tekućina je rezultat fosforescencije ili fluorescencije. Razlika između pojava je trajanje intervala između apsorpcije i emisije svjetlosti toka. Kada dođe do fluorescencije ovih procesa gotovo istovremeno, dok fosforescencije - sa zakašnjenjem.

istorijske informacije

1852., britanski naučnik Stokes, prvi opisao fluorescencije. Uveo je novi termin kao rezultat eksperimenata sa fluorit, koji emitiraju crveno svjetlo pod ultraljubičastim svetlom. Stokes napomenuti zanimljiv fenomen. Utvrđeno je da su talasne dužine fluorescentnog zračenja je uvijek veći od protoka svetlosti pobude.

Da biste potvrdili hipotezu u 19. stoljeću bilo je mnogo eksperimenata. Oni su pokazali da različite uzorke fluoroscirati pod utjecajem ultraljubičastog svjetla. Među materijalima, između ostalog, bio kristala, smole, minerale, klorofil, sirova droge, neorganska jedinjenja, vitamini, ulja. Direktnu upotrebu boje za biološkim ispitivanjima započela tek 1930. godine

Fluorescentne mikroskopije: opis

Neki od materijala koji se koriste u prvoj polovini studija 20. stoljeća izložena visoku specifičnost. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Zahvaljujući učinak, koji se nije mogao postići kontrastnim metoda, metoda fluorescentne mikroskopije je postao osnovni alat u biomedicinskim i biološka istraživanja. Jednako su dobijeni važne rezultate, a za materijale.

? Koje su prednosti metoda fluorescentne mikroskopije? Upotreba novih materijala postalo je moguće i izbor visoko specifična ćelije submikroskopske komponenti. Fluorescentne mikroskopije može otkriti jednu molekula. Mnoštvo boje omogućavaju identifikaciju više stavki odjednom. Bez obzira na ograničene prostorne rezolucije difrakcije granice opreme, koja, zauzvrat, zavisi od specifičnih svojstava uzorka, identifikaciju molekula ispod ovog nivoa je sasvim moguće. Razni uzorci nakon ozračivanja izložbu autofluorescence. Ovaj fenomen je naširoko koristi u petrologije, botanike, poluvodičke industrije.

Značajke

Studiraju životinjska tkiva ili patogena često komplikovane ili previše slab ili vrlo jaka nespecifični autofluorescence. Međutim, vrijednost u studije stiče uvod u komponente materijala uzbuđeni u određenom talasne dužine i emituje intenzitet potrebne protok svjetla. Fluorohroma djeluju kao boje u stanju samostalno u prilogu struktura (vidljivim ili nevidljivim). Tako oni imaju visoku selektivnost do cilja, a kvantni prinos.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescentne mikroskopije je naširoko koristi od pojave prirodnih i sintetičkih bojila. Oni posjedovao određeni profili intenzitet emisije i pobude i usmjerena na specifične biološke mete.

Identifikaciju pojedinačnih molekula

Često, u idealnim uvjetima, možete se registrovati zaseban element sjaj. Za ovaj je, između ostalog, potrebno je osigurati dovoljno niska razina buke detektora i optički pozadini. Floresceinom molekula na propast zbog photobleaching može emitovati do 300 hiljada. Fotona. Na efikasnost naplate 20% procesa i da ih registruju u iznosu od oko 60 hiljada.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescentne mikroskopije na osnovu lavina fotodiode ili elektronske množenje, omogućilo istraživačima da posmatraju ponašanje pojedinih molekula kroz drugu, au nekim slučajevima čak minuta.

složenost

Ključno pitanje u korist suzbijanju optičkih pozadinske buke. S obzirom na činjenicu da su mnogi od materijala koji se koriste u dizajnu filtera i objektiva pokazuju neke autofluorescence, napori naučnika u ranim fazama su orijentirana na proizvodnju komponenti koje imaju nisku fluorescenciju. Međutim, nakon eksperimenti doveli su do novih zaključaka. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Konkretno, utvrđeno je da fluorescentne mikroskopije, na osnovu ukupnih internih refleksija, omogućava da se postigne mali pozadinu i visokog intenziteta ekscitacije svjetlo.

mehanizam

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Načela fluorescentne mikroskopije, na osnovu ukupnih internih refleksija je upotreba letimičan talasa ili letimičan. To se događa na granici između medija sa različitim refrakcije indeksa. U ovom slučaju, svjetlosni snop prolazi kroz prizmu. Ona ima visok indeks prelamanja parametar.

Prizmu u susjedstvu u vodenom rastvoru ili staklo sa niskim parametara. Ako je snop svjetlosti usmjeren na to pod uglom koji je kritičniji, zrak je potpuno ogleda iz interfejsa. Ovaj fenomen, pak, izaziva nonpropagating talasa. Drugim riječima, generira elektromagnetsko polje koje prodire u medij s nižim indeksom prelamanja parametar na udaljenosti manjoj od 200 nanometara.

Prolaznim talas intenzitet svjetlosti bi bilo dovoljno da se uzbuditi fluorofora. Međutim, zbog svoje izuzetno male dubine, po obimu će biti vrlo mali. Rezultat je u pozadini na niskom nivou.

modifikacija

Fluorescentne mikroskopije se temelji na ukupnih internih refleksija, mogu biti implementirani sa epi-osvjetljenje. To zahtijeva leće sa visokim numerički otvor (najmanje 1,4, ali je poželjno da je postigla 1,45-1,6), a dijelom osvijetljen aparata polje. Potonji se postiže sa male veličine mjesto. Za veću ujednačenost koristeći tanak prsten, koji je blokiran od strane dijela potoka. Za kritične kut, nakon čega je totalni odraz, potrebna nam je visok nivo prelamanja od potapanja medij u objektiv i poklopac staklo mikroskopa.