Molekularne metode genetičkih istraživanja

Istražiti i identificirati varijante u DNA strukturi koristiti molekularne genetike metoda. Za svaku DNK regiji, koji istražuje ovaj region hromozoma, gen ili alel, metode razlikuju. U osnovi svaki molekularne genetike metoda se sastoji od neke ili druge manipulacije RNK i DNK. Sve ove metode se odlikuju ogroman složenosti, bez laboratorijskim uvjetima ne može izvršiti, a osoblje mora biti visoko kvalificirani. Ovaj rad se odvija u nekoliko faza.

faze

Prvo, RNK ili DNK uzorci koji se proizvode. Evo, molekularni genetski metoda se može primijeniti na gotovo svaki materijal: kap krvi, leukocita, fibroblasta kulture, sluznice (ogrebao), čak i folikula dlaka, - DNK može dobiti iz bilo kojeg uzorka. To je pogodan za korištenje bilo molekularne genetičke metode i njihove različite opcije i već dugo izoliran DNK čuvaju zamrznute. Druga faza je posvećen akumulacije željenog fragmenata (pojačanje) DNK, jer pomaže osigurati lančane reakcije polimeraze in vitro (in vitro bez uključivanja živog organizma). Kao rezultat toga, odabrani DNA fragment množi ovom lančanom reakcijom, a iznos DNK povećava bukvalno milion puta.

Treći korak u molekularne metode genetičkih istraživanja pretpostavlja se umnoženih ograničenje DNK (ova fragmentacija, suzenje ili rezanje). Ograničenje obavlja elektroforezom na poliakrilamidnom ili agaroznom gelu. Ova metoda molekularno-genetskih proučavanja DNA fragment omogućuje svima da se određenom položaju u gel. Nakon toga, gel se tretira sa Ethidium bromid, sposoban za vezivanje na DNK, zračenje sa ultraljubičastog svetla, onda je moguće pratiti luminiscencija porcije. Molekularne genetske dijagnostičke metode su različiti i brojni, ali prva dva koraka su zajednički za sve. Ali, u cilju identifikacije fragmenata DNK, gel može biti u boji, kao i mnoge druge postojeće metode.

vrsta

Najdirektniji i rasprostranjena metoda za detekciju mikobakterija mogu uključiti iznad molekularne metode učenja genetski DNK. Njegova suština je da, kako bi se utvrdili skeniranja lanac materijala specifičnih fragmenata DNK patogena. Molekularne genetske dijagnostičke tehnike još uvijek nemaju efikasniji način da prepoznaju bolesti kao što je tuberkuloza. Pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR), možete biti sigurni da će originalni DNA povećati broj kopija u milion puta, to jest, da će biti pojačanje, i to će prikazati rezultate. Razinu osjetljivosti je vrlo visoka - više od devedeset pet posto, što je glavna prednost ove metode.

Ostatak molekularno-genetičke metode istraživanja o efikasnosti prinosa više kopija doslovno udvostručio, jer u ovom slučaju izrade uzorka pokazuje određenu oligonukleotida sekvenca povećan stotinu šest puta. Čak je i dijagnoza kulture tuberkuloze respiratornog sistema značajno smanji osjetljivost. To je razlog zašto moderna medicina se temelji na molekularne genetičke metode dijagnostike tuberkuloze. A opisana metoda je efikasna, posebno kada se radi o patogenima visoke antigeni varijabilnosti, odrediti da drugi put je mnogo teže - zahtijeva posebnu hranjivoj podlozi i kultiviranje dugo vremena. Biohemijskih i molekularne genetičke metode proizvesti vrlo različit efekat na rezultate.

Dijagnoza tuberkuloze

Marshall PCR dijagnostika tuberkuloze najčešće koriste te DNK sekvence koje su specifične za sve četiri vrste bolesti. Da bi se postigao ovaj cilj često koriste kapisle koji otkrivaju sekvence IS elemenata (IS-986, IS-6110), kao ovi elementi karakteriziraju visoko migratornih vrsta Mycobacterium tuberculosis i uvijek prisutan više kopija u genomu. Također ekstrakciju DNK može se vršiti iz čiste kulture i kliničku (sputum bolesnika) bilo koji drugi prikladan način. Na primjer, postoji način Boom gdje lize se pufer koristi na osnovu Guanidine tiocijanata i silika kao nosilac DNK. Broj pacijenata koji se razlikuju loše bakteriološke svake godine povećava, a samim tim u kliničkoj praksi je uspostavila potpuno drugačiji nivo organizacije: molekularno-genetskih metoda proučavanja DNK je igrala glavnu ulogu u dijagnostici.

Ipak, moramo priznati da to nije bez mana. PCR metodom je upotreba često donosi veliki broj lažno pozitivnih rezultata, a razlog je, ne samo tehničke greške, ali i karakteristike same metode. Osim toga, koristeći ovu metodu dijagnoze odrediti održivost mikobakterija, koji su identifikovani, to je jednostavno nemoguće. Ali ovaj nedostatak nije najvažnije. Molekularne genetičke metode PCR dijagnostika podrazumijeva rizik od kontaminacije mikobakterijske DNK. zahtjeve certifikata iz tog razloga za laboratorije PCR ekskluzivno teško, oni zahtijevaju tri odvojene prostorije. PCR tehnologija je moderan i vrlo kompleksan, zahtijeva upotrebu odgovarajuće opreme i visoko obučeno osoblje.

bacterioscopy

Kada rezultati dijagnoza analize mora biti u usporedbi s drugim podacima: klinički pregled, radiografija, mikroskopiju, usjeva, pa čak i kao odgovor na poseban tretman su vrlo važni. U ovoj seriji, studije PCR je samo jedna od komponenti. Otkriti patogena u ranoj dijagnostici može biti najjednostavniji i najbrži način - bakteriološki.

Tu se koristi svjetlo mikroskop (bojanje Ziehl-Neelsen) i fluorescentne (bojenje fluorohroma). Prednost je brzina brisa rezultate. Ali njegova mana se s pravom smatra ograničenih kapaciteta zbog niske osjetljivosti. Međutim, ova metoda se daje preporuka WHO kao najekonomičniji i zemlju da otkrije pacijentima tuberkuloze. Detekciju mikobakterija bakterioloških metoda ima predviđanja vrijednosti i procijenjene kvantitativno bakterijske izlučivanje. Mnogo više samopouzdanja da se time bavi molekularnih metoda genetička istraživanja tuberkuloze.

kulture

Bolje detekciju mikobakterija prepoznaju kulturne studije. Sjetve patološki materijal je napravljen u medij jaje: Mordovsky, Finn II, LJ, i slično. Mjerila otpora mikobakterija za lijekove i indirektni dokazi o efikasnosti jednog broja mikobakterija i njihovih kolonija in vitro, ako primijenjene metode istraživanja kulture. Da se poveća postotak izolacije mikobakterija inokulacije patološkog materijala se održava na različitim okruženjima.

Zadovoljavanje potreba brojnih kulturnih, patogen uključujući donacije i tečnosti. Koristi se u ovom sistemu i automatizovan Vrsta merenja rast VANTES. Usjeva mora se održati u inkubacije do sedam do osam sedmica. Do tog trenutka usjeva sa nedostatkom rasta može se smatrati negativnim. Najefikasniji način da se otkrije Mycobacterium tuberculosis razmotriti bioloških uzoraka: dijagnostičkog materijala infekt zamoraca, koji su izuzetno podložni TB.

neke brojke

Zanimljivo područje studija, koju je otvorio PCR dijagnostika je za proučavanje M. tuberculosis - latentne infekcije. Savremeni koncept TB infekcije ukazuje na to da od stotinu ljudi koji su bili u kontaktu s M. tuberculosis, devedeset možda zaražene, ali samo deset od njih su se razvila aktivnu bolest. Drugi imaju TB imunitet, a zbog devedeset posto slučajeva infekcija ostaje latentna. Otkriti obrazac je pomogao molekularne genetike metoda.

Genetičari kažu da pedeset i pet posto onih čiji usjeva patološki materijal bili su negativni, a osamdeset posto ljudi zaraženih M. tuberculosis, ali teče bez radiografski manifestacija bolesti, PCR pozitivnih odgovora dobio. To je genetski dijagnostička metoda je pomogla da se identifikuju pacijenata sa rizikom studijama PCR, sa rezultatima njihovih analiza (mikroskopija i kultura) je negativan, a subkliničke infekcije M. tuberculosis bio prisutan.

savremena istraživanja

Ruske Federacije i bakteriološki laboratorija koristiti ubrzani način apsolutne koncentracije: nitrat reduktaze aktivnost testirao Grieß reagens mikobakterija. Anti-TB centara koristiti metoda koja omogućava da se utvrdi rezistencije. Ovo sjetve u tečnom mediju, gdje automatizirani radiometrijskom i fluorescentne računovodstveni sistem rasta mikobakterija. Takva analiza se obavlja brzo - do dvije sedmice.

Trenutno, nove metode se razvijaju: rezistencije mikobakterija se mjeri na nivou genotip. Studija molekularni mehanizmi gena otpornosti i pokazuje prisustvo u mikobakterija. Ovih gena su povezani sa otpornost na određene droge. Na primjer, Kasa geni, Inha, katG otporan na izoniazid, rpoB gena - rifampicin 16Sp RNA gena i rpsL - streptomicin, emb1 - na etambutol, Gira - fluorohinolonom i tako dalje.

mutacije

Moderne dijagnostike znatno povećao metoda molekularno-genetskom nivou za proučavanje DNK i dozvoljeno da sprovedu velikim studijama mutacija u svim njihovim spektra. Sada znamo da je najčešći mutacija u 516, 526 i 531 kodona na rpoB gena, i identifikovali otpornost na različite droge. Postoji čitav niz metoda za tipizaciju mikobakterija koristi ne samo tradicionalne metode - biokemijske, biološke i kulturne, ali i širokoj upotrebi modernih tehnika molekularne genetike. Već postoje adekvatni i dati ispravan način dijagnoze za detekciju monogenskih bolesti. Oni su zasnovani na DNK studijama u određenu oblast određenog gena. To je obično složen proces, dugotrajan i skup, ali podaci koje pružaju molekularne genetske analize, mnogo precizniji i informativnih od podataka svih drugih analiza.

Odavno je poznato da je DNK ne mijenja za cijeli život organizma da je na bilo koji ćelijama sa jedrom odnakova, a to omogućava da se analiza apsolutno svih ćelija tijela, u bilo kojoj fazi ontogeneze. Oštećeni gen može se otkriti prije pojave prvih simptoma do kliničke bolesti u punom obimu, kao i kod zdravih heterozigota ljudi, ali imaju mutacija gena. Molekularne genetske nasljedne bolesti dijagnostičkih metoda dopustiti da otkriju svoje (direktan pristup, DNK dijagnostike), kao i da analizira segregacije bolesti u porodici sa markerom lokusa DNK (genetski polimorfizam), koji su usko povezani sa oštećenim gena (tj indirektni pristup DNK dijagnostike). Direktno ili indirektno - DNA dijagnostika zasniva se na metodama identifikacije strogo definiran dio ljudskog DNK.

direktnih metoda

Direktne metode DNK dijagnostike su kada je krivac gen nasljedne bolesti poznate, kao dobro poznati, i vrste njegovih mutacija. Na primjer, odgovarajuća direktna metoda u velikom broju bolesti. Ovaj Huntington chorea (produžetak CTG-ponavljanja), fenilketonurije (R408W), cistična fibroza (delF508, velike mutacije) i slično. Glavna prednost direktna metoda je dijagnostička preciznost u stopostotnom vlasništvu, i nema potrebe da se uradi DNK analizu ostatka porodice. Ako se utvrdi da je mutacija u odgovarajući gen, što omogućava upravo odobri dijagnozu nasleđa, određivanje genotipa za ostatak opterećene porodice.

Još jedna prednost direktnog dijagnoza se smatra da se identifikuje heterozigot nosilac loših mutacija od rođaka i roditelja koji je umro od te bolesti. Ovo se posebno odnosi na bolesti autosomno recesivno. Nedostaci direktnih metoda također su dostupni. Da biste ih primijeniti, potrebno je da znate točno lokalizirati abnormalni gen, ekson-intron strukturu svog spektra i njegove mutacije. Nisu svi monogenskih bolesti danas su dobili takve informacije. Informativnosti direktnih metoda ne može se smatrati potpuna, jer je jedan te isti gen može imati veliki broj patoloških mutacija koja uzrokuje razvoj nasljednih bolesti.

indirektne metode

Indirektne metode u DNK dijagnostici se koriste u svim, u drugim slučajevima, ako je oštećen gen nije identifikovan, ali samo hromozomski, ili ako je dijagnoza linija nije dalo rezultat (to dogodi, ako, ako ima puno gen kompleks molekularne organizacije ili u velikoj mjeri patološke mutacije). Indirektne metode izvršena analiza segregacije polimorfnih markera u alelne porodice. Markera naći u istom kromosomske regije ili lokusa je usko povezano sa bolesti i predstavljaju brisanja ili umetanja, tačka supstitucije, ponavlja, i njihov polimorfizam je zbog različitih količina ćelija u bloku.

Najpogodniji za indirektno dijagnoze smatra mikrosatelitska i minisatellite polimorfizama, koji su široko rasprostranjeni u ljudskom genomu. njihova vrijednost izražena u visokim sadržajem informacije, ako je šteta na genetičke udaljenosti između marker i gena nije prevelik. U drugom slučaju, preciznost procjene se određuje u velikoj mjeri učestalost rekombinacije između polimorfnih markera i oštećenja. Indirektne dijagnostičke metode također pružaju obavezno preliminarni korak učestalost alela analiziranih studija populacije među pacijentima i nosioci mutacije, plus nužnost utvrđivanja vjerojatnost rekombinacije neravnotežnim i prijanjanja markera i mutant alela.

druge metode

Kratkim segmentima RNA ili DNA, kao i jednog gena vizualizirana pod mikroskopskim studija ne može biti, dakle, da se identifikuju mutacije koje su potrebne molekularne genetike dijagnozu. Tu je i "Human Genome Project", kao i drugih plasmana u molekularnoj genetici uvelike proširio mogućnost dijagnoze nasljedne bolesti - i pre i postnatalni. Ove metode mogu pružiti rano otkrivanje i napraviti predviđanje poli i monogenskih bolesti, čiji je debi odvija u odrasloj dobi. Nažalost, zbog tehničkih mogućnosti za molekularnu genetiku studije su ponekad izvan etičke granice koje su postavljene u odnosu na nasljedstvo, posebno kada je dijagnoza u adolescenciji i djetinjstvu.

Strukturnih i numeričkih kromosomskih abnormalnosti su najčešći uzroci bolesti i raka, kao i mnoge malformacije. Hromozomskih aberacija treba da budu identifikovani, što je važno za obitelj savjetovanje - za procjenu prognoze, zajedno sa reproduktivnim rizik u budućnosti trudnoća. analiza hromozoma je "zlatni standard" genetske dijagnoze, ali je ograničen. Samo metoda molekularne genetske analize mogu učiniti više, jer nekada kloniranje tehnologiju zasnovanu fluorescentnih oznaka u stanju da svoje visoke osjetljivosti za identifikaciju suptilne kromosomskih promjena koje su nemoguće otkriti klasične citogenetičkom studija. Ove tehnike se sve više širi naše dijagnostičke mogućnosti, prilikom ispitivanja, djeca sa smetnjama u razvoju, mentalnom retardacijom, uz mnoge druge nasljedne bolesti.

nalazi

To je vrlo važno za čovječanstvo su genetsku strukturu i funkciju znanja, vrste varijabilnosti, sposobnost da otkrije nasljedne bolesti koje su se dogodile u vezi sa razvojem molekularne genetike. njene metode su usmjerene na proučavanje DNK molekula - a kada je to normalno, a kada je oštećen. Priprema sekvenci dezoksiribonukleinske kiseline nukleotida (DNK) proteže se u fazama od prijema uzoraka za identifikaciju pojedinačnih fragmenata. Izolacija genomske DNA iz ćelija, ograničenje (suzenje), pojačanje (kloniranje), elektroforeza fragmenata (razdvajaju električni naboj i molekularne težine od agaroznom gelu). Identifikacija specifičnih fragmenata koji se nalazi na površini od diskretne pruge.

Zatim ulazi u posebnim filterima čin, kroz koji prolazi svaki fragment hibridizacije sa klonirane DNA fragmenata ili sintetičkog radioaktivnog sonde je kontrola, koja će biti jednaka za svaki test uzorak. Ako promijenite položaj ili dužinu u odnosu na sondu, ako novi fragment ili nestali - sve to ukazuje na to da analizirani gen je prošla restrukturiranja u sekvence nukleotida. Postoji osam osnovnih tehnika molekularne genetike studija: sekvenciranje (određivanje DNK sekvence), lančana reakcija polimeraze (povećanje broja sekvence), priprema prajmera poznatih gena, DNK kloniranje, proizvodnja rekombinantnih molekula izvedenih proteina zbog rekombinantne molekule, stvarajući kompletan set (zbirka biblioteka) klonirane fragmente koji su dobijeni pomoću ograničenja.